CRISPR-Cas9 mekanizması, hedeflenen DNA dizisini bulma ve keserek düzenleme yapma süreçlerini iki ayrı moleküler katmanda gerçekleştirir. Bu katmanları anlamak, neden belirli hedeflerin çalışıp çalışmadığını ve off-target kesim riskini açıklar. Sistem üç bileşenden oluşur: Cas9 proteini, crRNA (CRISPR RNA) ve tracrRNA. Modern uygulamalarda crRNA ile tracrRNA birleştirilerek sgRNA (single guide RNA) adı verilen tek bir kılavuz RNA oluşturulur. sgRNA'nın 5' ucundaki 20 nükleotidlik dizi, hedef DNA ile tamamlayıcı baz eşleşmesi yapar. PAM (Protospacer Adjacent Motif) dizisi, CRISPR-Cas9 mekanizmasının en kritik kısıtlayıcısıdır. S. pyogenes Cas9 için PAM dizisi 5'-NGG-3' şeklindedir. Cas9, önce PAM'ı DNA'da tarar; PAM bulunan bölgede sgRNA ile protospacer arasındaki tamamlayıcılığı kontrol eder. PAM olmadan R-loop oluşumu başlamaz ve DNA kesilmez. Bu mekanizma, bakterinin kendi genomunu kesmesini önler: bakterinin kendi CRISPR lokusu PAM içermez. Kesim mekanizması iki ayrı nükleaz domeninden gelir. RuvC domine, PAM'a uzak ipliği keser; HNH domine, protospacer ile tamamlayıcı ipliği keser. Her ikisi koordineli olarak çift sarmal kırığı (DSB) oluşturur. DSB, hedef dizinin PAM'a komşu ucundan tam olarak 3 nükleotid yukarısında gerçekleşir. CRISPR-Cas9 mekanizması sonrasında hücre onarım yollarından birine girer. NHEJ (non-homologous end joining), hızlı ama hatalı birleştirme yapar; bu yol ile çerçeve kayması mutasyonları (indel) ve gen bozulması sağlanır. HDR (homology-directed repair) ise donor şablonu kullanılırsa tam spesifik düzenleme imkânı tanır; ancak HDR verimliliği NHEJ'den çok daha düşüktür ve hücre döngüsünün S/G2 fazıyla sınırlıdır. Off-target etkiler, sgRNA'nın tam eşleşme olmayan bölgelere de bağlanabilmesinden kaynaklanır. Tolerans özellikle PAM'dan uzak konumlarda daha yüksektir; 3 bulge veya mismatch'e kadar kesilme bildirilmiştir. GUIDE-seq ve CIRCLE-seq gibi deneysel yöntemler, off-target profili tüm genomda haritalandırır.