Bu başlığı kendi laboratuvar pratiğimden çıkardığım protokolü adım adım paylaşmak için açıyorum. Lisansüstü öğrencilerin sıkça takıldığı noktalar var, özellikle doku lizatı kalitesi ve transfer verimi konusunda. Standart bir IgG hedefli memeli dokusu çalışması üzerinden anlatıyorum, kendi sisteminize göre uyarlayın. 1. Doku hasadı ve lizat hazırlığı Doku hasat edildikten sonra mümkün olan en kısa sürede sıvı azotta dondurulmalı. Buz üzerinde tartım yapıp ağırlığın yaklaşık 10 katı hacimde soğuk lizis tamponu eklenir. Standart RIPA tamponu yaygın kullanılıyor, ama fosforile proteinler için fosfataz inhibitörü, tüm protein çalışmalarında ise proteaz inhibitör kokteyli eklemeyi unutmayın. Doku Dounce homojenizatöründe veya soğutmalı bilyalı homojenizatörde parçalanır. Buzda 30 dakika bekletme ve 14.000 g'de 15 dakika santrifüj sonrası süpernatant alınır. BCA veya Bradford ile protein konsantrasyonu ölçülür. 2. Örnek hazırlığı Genelde kuyu başına 20 ile 40 mikrogram protein yüklüyorum. Laemmli tamponu 1x final konsantrasyonda eklenir, beta-merkaptoetanol veya DTT ile indirgeyici koşul sağlanır. 95 derecede 5 dakika denatürasyon. Membran proteinleri için bu sıcaklık agregasyona yol açabilir, o durumda 70 derecede 10 dakika tercih edilir. 3. SDS-PAGE Hedef proteinin molekül ağırlığına göre jel yüzdesi seçilir. 10 ile 70 kDa için yüzde 12, 70 ile 200 kDa için yüzde 8 ile 10. Yığma jeli 80 V'de 15 dakika, ayırma jeli 120 V'de tampon ısınmadan yürütülür. Molekül ağırlık belirteci her kuyu setine eklenmeli. 4. Transfer Islak transferi tercih ediyorum, gece boyu 30 V'de 4 derecede yapılan transferin küçük proteinlerde aşırı geçişe, büyük proteinlerde eksik transfere yol açtığını gördüm. Standart olarak 100 V'de 60 ile 90 dakika, buzda, transfer tamponu soğuk. PVDF membran metanolle ön-aktive edilir, nitroselüloz için bu adım gerekli değil. Transferden sonra Ponceau S boyaması ile yüklenen miktar ve transfer homojenliği görsel olarak doğrulanır. 5. Bloklama ve antikor inkübasyonu Yüzde 5 yağsız süt tozu veya yüzde 5 BSA TBST içinde, oda sıcaklığında 1 saat. Fosfo-spesifik antikorlar süt kazeini ile etkileşebileceği için BSA tercih edin. Primer antikor üreticinin önerdiği seyreltmede gece boyu 4 derecede. Sabah TBST ile üç kez 10 dakikalık yıkama, sekonder HRP-konjuge antikor 1 saat oda sıcaklığında, ardından dört kez 10 dakikalık yıkama. 6. Görüntüleme ECL substratı uygulanır, dijital görüntüleyici ile farklı pozlama sürelerinde çekim yapılır. Doygun bantlar densitometriyi bozar, lineer aralıkta kalmaya özen gösterin. 7. Densitometrik analiz Görüntü analizini ImageJ veya benzeri açık kaynak yazılımla yapıyorum. Her bant için arka plan çıkarılır, integrated density alınır ve aynı membrandaki yükleme kontrolüne normalize edilir. Tek yükleme kontrolü yerine total protein normalizasyonu (stain-free veya Ponceau temelli) son yıllarda daha güvenilir kabul ediliyor. En az üç bağımsız biyolojik tekrar olmadan istatistiksel yorumlama önerilmez. Sık karşılaştığım sorunlar Yüksek arka plan: bloklama yetersiz, sekonder antikor çok konsantre veya yıkama eksik. Çift bant: kısmi proteoliz veya post-translasyonel modifikasyon. Sinyal yokluğu: transferin gerçekleşmediği veya primer antikorun spesifik olmadığı durumlarda görülür, pozitif kontrol kullanın. Protokol bütün laboratuvarlara birebir uymaz. Sizin sıkça karşılaştığınız sorunlar varsa altta paylaşırsanız ortak bir sorun giderme listesi çıkarabiliriz.